华山医院康复医学科新发现

时间：2020-06-22 09:14 来源：上海市作者：李思玥通讯员：任羿诚

住培、专培基地科研动态

华山医院康复医学科新发现：

肝细胞生长因子通过调控细胞内铁代谢途径

保护OGD/R诱导的神经元损伤—基础研究

李思玥华山康复医学科 6月1日

科研动态

复旦大学附属华山医院康复医学科

复旦大学附属华山医院康复医学科最新基础研究报道：肝细胞生长因子是一种多效性细胞因子，在神经系统损伤和修复过程中发挥重要作用，但其神经保护作用所涉及的机制尚未完全阐明。我们的研究表明，HGF还原铁的能力可能是在缺血/再灌注条件下发挥其神经保护作用相关的机制之一。HGF主要通过上调Fpn1从而介导细胞铁输出的增加来减少细胞内铁含量，从而保护PC12细胞免受OGD/R诱导的损伤。该研究于2020年4月，以“肝细胞生长因子通过降低细胞内铁保护神经元免受氧糖剥夺诱导的损伤”(Hepatocyte growth factor protects PC12 cells against OGD/R-induced injury by reducing iron)为题，在线发表在生物学领域期刊《Bioscience Reports》（IF=2.535）上，现以母语说明如下：

引言

肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor, HGF）是一种间质来源的多功能的神经营养因子，参与机体多种细胞组织器官的生长、再生和重塑过程，在神经系统损伤和修复过程中发挥重要作用。多项研究表明，HGF能减轻短暂性大脑中动脉闭塞模型大鼠的神经功能缺损；也可以保护短暂性前脑缺血雄性Wistar大鼠的海马神经元免受缺血后细胞凋亡；也能显著改善微球栓塞大鼠的学习和记忆功能障碍，以及由脑缺血引起的血脑屏障的破坏等。但是， HGF的神经保护作用所涉及的机制尚未完全阐明。

铁是大脑中最丰富的微量金属。像所有细胞一样，神经元在其生理过程中也需要铁。另一方面，铁也是活性氧（reactive oxygen species ，ROS）在大脑中异常增加时的主要产生元素。铁诱导的ROS能够破坏生物分子并导致神经元损伤。此外，铁超载已被认为是脑缺血的病理机制之一，同时也是ROS的主要来源，并且是缺血/再灌注或缺氧/复氧引起的脑损伤的原因。此外，HGF通过抑制铁调素对体内铁代谢与铁平衡稳态的维持具有重要作用。

由此，我们研究了HGF在氧葡萄糖剥夺和复氧（OGD/R）处理的PC12细胞中对铁调素表达的影响，以及对细胞铁输入转铁蛋白受体1（TfR1）、二价金属转运蛋白1（DMT1）、细胞铁输出蛋白1（Fpn1）、细胞铁储存蛋白铁蛋白（ferritin）、铁调节蛋白1和铁调节蛋白2（IRP1和IRP12）等的影响。我们证明，HGF主要通过上调Fpn1增加细胞内铁的输出，减少细胞内铁含量，从而改善OGD/R诱导的PC12神经元铁超负荷状态。

结果分析

1. OGD/R环境下，HGF预处理增强PC 12细胞活力，且能上调Fpn1、下调Ft-L，但对TfR1和DMT1的表达没有明显影响。

用40 ng/ml浓度的HGF预处理PC12细胞一小时后暴露于OGD 6小时/ R 24小时环境下，细胞活力的增强最为明显。我们也发现，TfR1（图2A）和DMT1（图2B）的表达高于未使用HGF的组别，但差异不显著。而HGF预处理后，Fpn1（图2C）在 OGD/R环境下的表达较未处理组相比明显降低，表明HGF预处理可以逆转OGD/R对Fpn1的抑制作用。而HGF + OGD/R联合处理的细胞中Ft-L（图2D）的含量明显低于仅用OGD/R处理的细胞，这表明HGF能够降低OGD/R导致的PC12细胞内铁的储存含量。

2. OGD/R环境下，HGF预处理PC 12细胞能下调hepcidin mRNA和上调IRP1蛋白表达。

哺乳动物的铁代谢或铁转运和贮铁蛋白的表达受IRPs及铁调素系统地调控。因此，我们进一步研究了在OGD/R环境下，HGF如何影响铁转运和贮铁蛋白的表达。在OGD/R环境下，HGF预处理较未处理相比， IRP2的表达没有显着差异，这表明HGF对缺氧条件下IRP2的表达没有影响。但是，OGD/R条件下Hepcidin mRNA的表达和IRP1蛋白的减少，用HGF + OGD/R共同处理的细胞中hepcidin mRNA的表达明显较低（图3A），而IRP1蛋白表达则较高（图3B），而与仅用HGF处理的常氧细胞相比，无明显差异。这表明，HGF可以逆转OGD / R对铁调素和IRP1的影响。

3. HGF影响OGD / R处理的PC12细胞中铁转运、铁储存和调节蛋白或mRNA表达的示意图。

HGF与其受体（c-Met）的结合激活了细胞内信号传导途径。激活的信号通路诱导铁调素hepcidin显著减少、IRP1表达增加。Fpn1的表达受铁调素和IRP的控制；然而，铁调素可能在OGD/R条件下起主导作用。因此，Fpn1表达的增加主要归因于HGF诱导的hepcidin表达的下调。Fpn1表达的增加和Fpn1介导的铁从细胞中的释放会导致Ft-L含量的显著降低。TfR1和DMT1表达的轻微增加可能与IRP1表达的增加有关。而HGF与c-Met受体结合激活的细胞内信号传导途径尚不清楚，因此需要对此进行进一步的研究。

讨论

细胞内铁含量和铁平衡主要取决于铁摄取和铁释放蛋白的表达，其中，TfR1和DMT1是铁摄取的主要蛋白，TfR1/DMT1介导的转铁蛋白结合铁（Tf-Fe）是哺乳动物细胞铁蓄积的主要途径。Fpn1是目前唯一确定的细胞内铁输出蛋白。铁蛋白Ferritin 有两种同工型：重链（Ft-H）和Ft-L中，Ft-H具有亚铁氧化酶活性，而Ft-L缺乏亚铁氧化酶活性，但可以储存更多的铁，是反映细胞内铁储存含量的良好标志。在本研究中，我们证明了用HGF+OGD/R共处理的PC12细胞中Ft-L的含量明显低于仅用OGD/R处理的细胞，这表明HGF干预能够减少OGD/R处理的PC12细胞中的细胞内铁的储存。同时，我们发现HGF干预可以使Fpn1的表达上调，但对OGD/R处理的PC12细胞中TfR1和DMT1的表达没有显着影响，这提示了HGF降低细胞内铁含量的能力主要是通过其上调Fpn1的表达，从而促使Fpn1介导的细胞内铁输出增加。而且HGF干预在OGD / R处理的PC12细胞中可以下调铁调素mRNA。这提示，Fpn1表达的增加主要归因于HGF下调hepcidin表达的作用，即HGF诱导的Fpn1表达的上调是通过调控铁调素介导的过程。

在本研究中，我们还发现，HGF干预OGF/R处理的PC12细胞后，IRP1（而非IRP2）蛋白的表达显着增加。与仅用OGD/R处理的细胞相比，这可能与HGF + OGD / R共同处理的细胞中TfR1和DMT1的表达增加有关（尽管没有统计学意义）。该研究结果还能提示，HGF诱导的Ft-L含量的减少不仅是由于铁调素和Fpn1表达的变化，而且还归因于IRP1表达的增加。这表明，与IRP / IRE系统相比，铁调素系统在调控OGD/R处理的PC12细胞中Fpn1的表达的过程中可能起主导作用。

局限性

由HGF与c-Met受体结合激活并参与HGF对铁调素和IRP表达的调节的细胞内信号传导途径仍未知，需要对此问题进行进一步研究。

讨论

研究结果表明，HGF能够逆转OGD/R诱导的PC12细胞中Fpn1和IRP1蛋白表达的降低以及Ft-L蛋白和铁调素mRNA含量的增加。同时，HGF能够通过抑制铁调素hepcidin的表达，促进Fpn1含量增加和Fpn1介导的铁从细胞中释放，进而减少脑铁超载。

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吴毅教授点评：

我科李思玥、徐高静同学从基础研究的角度提出了肝细胞生长因子HGF发挥神经保护作用的一个潜在的新的机制。既往的基础研究证实了丰富环境（Enriched Environment，EE）对脑卒中后动物模型神经功能的改善具有良性影响，然而功能改善背后的确切机制却没有一个系统完整的解释。而在我们对EE原理探讨的过程中发现，HGF作为神经营养因子，也参与了EE发挥缺血性脑卒中的神经保护作用的机制。目前已有研究表明，HGF在脑缺血后能有效诱导血管生成、保护血脑屏障、缓解神经元损伤，促进脑卒中恢复，但HGF的神经保护作用的机制尚未完全阐明。因此，我们采用离体实验模型研究了HGF对神经元是否具有直接保护作用，以消除体内各种因素干扰。我们阐明了HGF 对PC12神经元具有直接的保护作用，并呈一定的剂量依赖关系，而且证实了HGF与铁代谢各项指标之间的关系及其相互影响的机制。但本研究的不足之处在于，若能将EE干预血清用以培养神经元细胞，或许能实现体外EE干预措施，再结合在体实验，从而探讨HGF对EE促进脑缺血神经元保护作用的治疗机制或能更为明了。但本项基础研究还是具有一定的参考意义，为临床应用 HGF 治疗脑缺血损伤提供实验依据，并为采取有效安全的脑缺血防治策略提供了新的线索。

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作者简介

李思玥 复旦大学附属华山医院2018级康复医学与理疗学专业博士研究生，师从吴毅教授。主要研究方向：损伤脑的临床和基础研究。目前以第一作者发表SCI论文4篇。

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